عدد المراحل الأساسية لتفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل في كل دورة من دورات التفاعل:
مرحلتان فقط
ثلاث مراحل أساسية
أربع مراحل منفصلة
خمس مراحل متتالية
سبب تفضيل النهايات اللزجة على النهايات غير اللزجة في كثير من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية:
كون النهايات غير اللزجة أسهل في الالتحام من اللزجة
عدم وجود أي فرق عملي بين النوعين
كون النهايات اللزجة لا تحتوي على أي نيوكليوتيدات
سهولة التحامها بنهاية لزجة مكمّلة من قطعة DNA أخرى، خلافًا لصعوبة التحام النهايات غير اللزجة
أهمّية إنزيم النسخ العكسي في تقنيات مقارنة التعبير الجيني:
قطع جزيء DNA في مواقع محدّدة فقط
ربط قطع DNA المقطوعة ببعضها فقط
تضخيم عيّنة صغيرة من DNA فقط دون أي دور آخر
عزل وإنتاج جين معيّن من خلال نسخ RNA إلى DNA
إنزيم بلمرة DNA متحمّل للحرارة، يُستخلَص من نوع بكتيريا محبّة للحرارة تعيش في الينابيع الحارّة، ويُعدّ أساسيًّا في تقنية تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل:
إنزيم Taq DNA Polymerase
إنزيم الربط
إنزيم النسخ العكسي
إنزيم القطع المحدّد
نوع من نواقل الجينات يُستخدَم عندما تكون قطع DNA المراد نقلها كبيرة الحجم بعد تعديلها جينيًّا بإنزيمات القطع المحدّد وإنزيم الربط:
الجسيمات الدهنية (Liposomes)
البلازميدات وحدها فقط
إنزيمات القطع المحدّد وحدها
الفيروسات آكلة البكتيريا (Bacteriophages)
نوع القطع الناتج من بعض إنزيمات القطع المحدّد، وتتكوّن نهاياته من سلسلتين من النيوكليوتيدات، ويصعب التحامها بسلاسل أخرى:
النهايات اللزجة
النهايات المفردة القابلة للالتحام السريع
النهايات غير اللزجة (Blunt Ends)
نهايات سلسلة البدء
سبب استخدام النوع نفسه من إنزيم القطع المحدّد لقطع الجين المرغوب فيه وقطع الناقل الجيني عند إنتاج DNA معاد تركيبه:
لضمان تطابق النهايات اللزجة الناتجة من كلا القطعين، ما يسهّل التحامهما ببعض لاحقًا بواسطة إنزيم الربط
لتقليل تكلفة العملية فقط دون أي غاية علمية
لأنّ استخدام إنزيمين مختلفين مستحيل تقنيًّا
لا داعي علمي لاستخدام الإنزيم نفسه، ويمكن استخدام أي إنزيم آخر
المرحلة الثانية من تفاعل PCR، التي تُربَط فيها النهاية المفردة للسلاسل الأُحادية بسلاسل البدء، وتتطلّب درجة حرارة تتراوح بين (55-65°C):
مرحلة الفصل
مرحلة الربط (Ligation/Annealing Stage)
مرحلة الاستطالة
مرحلة التبريد النهائي
الخطوات الأساسية لاستخدام الفيروس آكل البكتيريا ناقلًا جينيًّا، تبدأ بـ:
ربط DNA الفيروس بقطعة DNA المراد إضافتها مباشرة دون أي قطع مسبق
حقن الفيروس مباشرة في الخلية المستهدَفة دون أي تعديل مسبق
تدمير الغلاف البروتيني للفيروس قبل أي تعديل
قطع DNA الفيروس بواسطة إنزيم القطع المحدّد، ثم ربطه بقطعة DNA المراد إضافتها بواسطة إنزيم الربط
العلاقة بين خرائط القطع (Restriction Maps) الناتجة عن الفصل الكهربائي الهلامي، وإمكانية التمييز بين تسلسلات DNA لأفراد مختلفين (كما في البصمة الوراثية):
تكون خريطة القطع متطابقة تمامًا لدى جميع الأفراد من النوع نفسه دون أي استثناء
لا علاقة بين خرائط القطع وأي إمكانية للتمييز بين الأفراد
يختلف نمط قطع DNA (وبالتالي خريطة القطع الناتجة) من فرد لآخر تبعًا لاختلاف تسلسل النيوكليوتيدات لديهم في مواقع القطع، ما يجعلها أداة للتمييز بين الأفراد
تقتصر خرائط القطع على استخدام واحد فقط هو دراسة الطفرات دون أي استخدام آخر
العلاقة بين طبيعة عمل إنزيم النسخ العكسي واستخدامه لإنتاج نسخة DNA من جين نشط (يُعبَّر عنه بكثرة كـmRNA) في خلية معيّنة:
لا يمكن لإنزيم النسخ العكسي التعامل مع أي جزيء RNA إطلاقًا
يعمل إنزيم النسخ العكسي فقط على DNA لا RNA
يمكن استخدام إنزيم النسخ العكسي لتحويل mRNA الناتج من جين نشط إلى DNA مكمّل (cDNA)، ما يساعد في دراسة التعبير الجيني لهذا الجين
يُنتج إنزيم النسخ العكسي بروتينًا مباشرة دون أي جزيء نووي وسيط
المنطقة التي يتعرّف عندها إنزيم القطع المحدّد تسلسل النيوكليوتيدات المستهدَف في جزيء DNA:
منطقة أصل التضاعف
منطقة المُحفّز (Promoter)
منطقة التعرّف (Recognition Site)
منطقة الإنترون
دور الجسيمات الدهنية (Liposomes) في نقل الأليلات السليمة أو الأدوية في المعالجة الجينية، بالمقارنة بالبلازميدات والفيروسات:
تعمل الجسيمات الدهنية بالآلية الحيوية نفسها التي تعمل بها البلازميدات تمامًا
لا تُستخدَم الجسيمات الدهنية إطلاقًا في أي تطبيق طبي فعلي
تقتصر وظيفة الجسيمات الدهنية على قطع DNA فقط كإنزيمات القطع المحدّد
توفّر الجسيمات الدهنية وسيلة نقل غير حيّة (غير بكتيرية أو فيروسية) للمادة الوراثية أو الدواء عبر تركيبها الشحمي المتوافق مع الغشاء البلازمي للخلية المستهدَفة
إذا بدأ تفاعل PCR بجزيء DNA واحد، فإنّ عدد جزيئات DNA الناتجة بعد n دورة من دورات التفاعل يُحسَب بالصيغة:
n × 2
2 × n
n مرفوعة للأس 2
2 مرفوعة للأس n (2^n)
المرحلة الأولى من تفاعل PCR، التي تُحطَّم فيها الروابط الهيدروجينية بين القواعد النيتروجينية في سلسلتي DNA لفصلهما، وتتطلّب درجة حرارة تتراوح بين (94-96°C):
مرحلة الربط
مرحلة التبريد
مرحلة الفصل (Denaturation Stage)
العلاقة بين حاجة إنزيم بلمرة DNA (سواء الطبيعي أو المتحمّل للحرارة المستخدَم في PCR) إلى نهاية 3′ حرّة توفّرها سلسلة البدء، وما دُرس سابقًا حول آلية تضاعف DNA الطبيعية داخل الخلية:
لا يحتاج إنزيم بلمرة DNA المستخدَم في PCR لأي سلسلة بدء خلافًا للتضاعف الطبيعي
يحتاج التضاعف الطبيعي لسلسلة بدء بينما لا يحتاجها تفاعل PCR إطلاقًا
يتشابه المبدأ الأساسي؛ فكلا النوعين من الإنزيمات (الطبيعي والمستخدَم في PCR) يحتاج نقطة انطلاق مزدوجة السلسلة (RNA primer طبيعيًّا أو DNA primer صناعيًّا في PCR) ليبدأ إضافة النيوكليوتيدات منها
لا علاقة بين آلية عمل الإنزيمين في الحالتين
المرحلة الثالثة من تفاعل PCR، التي تُبنى فيها جزيئات DNA جديدة وكاملة بواسطة إنزيم بلمرة DNA المتحمّل للحرارة، وتتطلّب درجة حرارة تتراوح بين (70-75°C):
مرحلة الاستطالة (Extending Stage)
مرحلة التعرّف
الصبغة المستخدَمة لإظهار قطع DNA على المادة الهلامية عند تصويرها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية بعد انتهاء الفصل الكهربائي:
صبغة خاصة بـ DNA
صبغة اليود العادية
صبغة الميثيلين الأزرق
لا حاجة لأي صبغة في هذه العملية
العلاقة بين تفاعل PCR وتقنية الفصل الكهربائي الهلامي، من حيث الترتيب المنطقي لاستخدامهما في تحليل عيّنة DNA:
غالبًا ما تُستخدَم تقنية PCR أولًا لتضخيم كمّية DNA المتوافرة إلى مستوى قابل للتحليل، ثم يُستخدَم الفصل الكهربائي الهلامي لفصل القطع الناتجة ودراستها
يجب استخدام الفصل الكهربائي الهلامي دائمًا قبل PCR لا بعده
لا علاقة بين التقنيتين، ولا تُستخدَمان معًا في أي تحليل واحد
تُستخدَم تقنية PCR فقط بعد تحليل النتائج بالفصل الكهربائي لا قبله
إذا خضع جزيء DNA واحد لخمس دورات من تفاعل PCR، فإنّ عدد جزيئات DNA الناتجة يساوي:
10 جزيئات
16 جزيئًا
64 جزيئًا
32 جزيئًا
جهاز يُستخدَم لضبط درجات الحرارة المتغيّرة اللازمة لمراحل تفاعل PCR الثلاث بصورة متكرّرة وآلية:
جهاز الدوريّة الحرارية (Thermal Cycler)
جهاز الفصل الكهربائي الهلامي
جهاز الطرد المركزي
جهاز الموجات فوق الصوتية
تقنية تعتمد على مضاعفة عيّنة صغيرة من DNA لإنتاج ملايين النسخ منها خلال ساعات عدّة باستخدام جهاز الدوريّة الحرارية:
الفصل الكهربائي الهلامي
تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل (PCR)
البصمة الوراثية
تقنية النسخ العكسي وحدها
ما يمكن الاستدلال عليه من احتواء البلازميد المستخدَم في التكنولوجيا الحيوية على جين مقاوم لمضاد حيوي معيّن:
لا فائدة عملية لوجود هذا الجين في البلازميد
يمنع هذا الجين البكتيريا من النمو نهائيًّا
يمكن استخدام هذا الجين لتمييز البكتيريا التي استقبلت البلازميد بنجاح (تنمو رغم وجود المضاد الحيوي) من التي لم تستقبله
يقتصر دور هذا الجين على مضاعفة البلازميد فقط
سبب حاجة تفاعل PCR إلى سلاسل بدء (Primers) قبل أن يبدأ إنزيم بلمرة DNA عمله:
عدم حاجة الإنزيم لأي بداية محدّدة إطلاقًا
حاجة إنزيم بلمرة DNA المتحمّل للحرارة إلى وجود تسلسل DNA مزدوج ليبدأ بناء السلسلة المكمّلة منه
كون سلاسل البدء تحلّ محلّ إنزيم بلمرة DNA بالكامل
كون سلاسل البدء تمنع عمل الإنزيم بدلًا من تمكينه
التقنية التي تفصل قطع DNA اعتمادًا على شحنتها السالبة والاختلاف في أطوالها، باستخدام جهاز يحوي مادة هلامية وتيارًا كهربائيًّا:
تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل
البصمة الوراثية مباشرة دون أي فصل
الفصل الكهربائي الهلامي (Gel Electrophoresis)
تقنية النسخ العكسي
سلاسل مفردة قصيرة من النيوكليوتيدات (قد تصل إلى 20 نيوكليوتيدة أو أكثر)، مصمّمة لتكون مكمّلة لتسلسل بداية منطقة التضاعف المراد بناؤها في تفاعل PCR:
سلاسل البدء (Primers)
إنزيمات القطع المحدّد
البلازميدات
العلاقة بين تعدّد أنواع إنزيمات القطع المحدّد (مثل EcoR I وBamH I وHind III) وتنوّع مناطق التعرّف التي يتعرّفها كل نوع منها على جزيء DNA:
يتعرّف كل نوع من إنزيمات القطع المحدّد تسلسلًا نيوكليوتيديًّا محدّدًا يختلف عن تسلسل الأنواع الأخرى، ما يمنح الباحثين مرونة في اختيار الإنزيم المناسب لموقع القطع المطلوب
تتعرّف جميع أنواع إنزيمات القطع المحدّد التسلسل نفسه تمامًا دون أي اختلاف
يقتصر استخدام كل نوع من هذه الإنزيمات على نوع واحد فقط من البكتيريا دون أي استخدام آخر
لا علاقة بين نوع الإنزيم وتسلسل النيوكليوتيدات الذي يتعرّفه
الإنزيم الذي يُستخرَج من الفيروسات، وينسخ قالب الحمض النووي الريبوزي RNA إلى نسخة من DNA، في اتجاه معاكس للاتجاه المعتاد لانتقال المعلومات الوراثية:
إنزيم بلمرة DNA المتحمّل للحرارة
إنزيم النسخ العكسي (Reverse Transcriptase)
الإنزيم المستخدَم في التكنولوجيا الحيوية لربط الجين المعزول وإنتاج DNA معاد تركيبه، وربطه بناقل الجينات، عن طريق تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر:
إنزيم الربط (DNA Ligase)
إنزيم بلمرة RNA
العلاقة بين وجود منطقة مُحفّز عوامل النسخ (Promoter) ضمن تركيب البلازميد المستخدَم في التكنولوجيا الحيوية، ومفهوم بدء عملية النسخ الذي دُرس سابقًا في الوحدة الثانية:
تُتيح هذه المنطقة ارتباط عوامل النسخ وإنزيم بلمرة RNA لبدء نسخ الجين المُدرَج في البلازميد داخل الخلية المضيفة
لا علاقة بين منطقة المُحفّز في البلازميد ومفهوم بدء النسخ المدروس سابقًا
تمنع منطقة المُحفّز أي عملية نسخ للجين المُدرَج في البلازميد
تقتصر وظيفة منطقة المُحفّز على تضاعف البلازميد فقط دون أي نسخ
نوع البكتيريا التي يُستخلَص منها إنزيم Taq DNA Polymerase، والتي تعيش في بيئات شديدة الحرارة كالينابيع الحارّة:
Escherichia coli
Thermus aquaticus
Bacillus amyloliquefaciens
Haemophillus influenzae
سبب استخدام الفيروسات آكلة البكتيريا كنواقل جينات لقطع DNA كبيرة الحجم بدلًا من البلازميدات في بعض الحالات:
عدم قدرة البلازميدات على حمل أي DNA إضافي إطلاقًا
كون الفيروسات دائمًا أسهل استخدامًا من البلازميدات في كل الحالات
محدودية السعة التي يمكن للبلازميد حملها من DNA إضافي مقارنة بقدرة بعض الفيروسات على حمل قطع أكبر حجمًا
عدم وجود أي فرق في السعة بين البلازميدات والفيروسات
أساس تسمية إنزيمات القطع المحدّد (مثل EcoR I وHind III)، بحسب الجدول التوضيحي لأنواعها:
لون البكتيريا المنتِجة لها فقط
جنس البكتيريا المنتِجة لها، ونوعها، وترتيب اكتشاف الإنزيم
حجم جزيء DNA الذي تقطعه فقط
درجة الحرارة التي تعمل عندها فقط
نوع القطع الناتج من بعض إنزيمات القطع المحدّد، وتتكوّن نهاياته من سلسلة واحدة مفردة من النيوكليوتيدات يسهل التحامها بنهاية مكمّلة من قطعة DNA أخرى:
النهايات اللزجة (Sticky Ends)
النهايات المزدوجة الثابتة
نهايات القطع العشوائية
الأدوات المستخدَمة لنقل الجين المرغوب فيه إلى الخلية الحيّة المستهدَفة من التعديل الجيني:
نواقل الجينات (Vectors)
إنزيمات الربط وحدها
منطقة على البلازميد تسمح بتضاعفه بصورة مستقلّة داخل الخلية البكتيرية:
منطقة مُحفّز عوامل النسخ (Promoter)
منطقة أصل التضاعف (Origin of Replication - ORI)
منطقة التعرّف لإنزيمات القطع المحدّد
الجين المقاوم للمضادات الحيوية
المكوّنات الأساسية اللازمة لإتمام تفاعل PCR:
عيّنة RNA فقط دون أي DNA
عيّنة DNA المراد مضاعفتها، وإنزيم بلمرة متحمّل للحرارة، ونيوكليوتيدات حرّة، وسلاسل بدء (Primers)
إنزيم القطع المحدّد وإنزيم الربط فقط
بلازميد وفيروس آكل بكتيريا فقط
جزيء DNA حلقي موجود في سيتوبلازم البكتيريا، يتضاعف بصورة مستقلّة، ويُستخدَم كناقل جينات شائع في التكنولوجيا الحيوية:
الفيروس آكل البكتيريا
البلازميد (Plasmid)
الجسيم الدهني (Liposome)
الميتوكوندريا البكتيرية
سبب استخدام جهاز الطرد المركزي أحيانًا في سياقات تشخيص الاختلالات الوراثية المرتبطة بتقنيات التكنولوجيا الحيوية (كما درست سابقًا في فحص السائل الرهلي):
تضخيم عيّنة DNA كما يفعل جهاز الدوريّة الحرارية
فصل الخلايا عن السائل المحيط بها للحصول على كمّية كافية منها لإجراء التحاليل اللازمة
قطع جزيء DNA في مواقع محدّدة كإنزيمات القطع
فصل قطع DNA بحسب طولها كجهاز الفصل الكهربائي
الإنزيمات المتخصّصة التي تتعرّف تسلسلًا محدّدًا من النيوكليوتيدات في جزيء DNA، وتقطعه عند مواقع محدّدة بين نيوكليوتيدين متتاليين:
إنزيمات القطع المحدّد (Restriction Enzymes)
إنزيمات الربط
مجال علمي يهتم بتوظيف الكائنات الحيّة والمعلومات المتعلّقة بها في مجالات عدّة، واستخدامها في صنع بعض المنتجات وتطويرها لخدمة البشرية:
الهندسة الوراثية فقط
علم الوراثة الكلاسيكي فقط
علم التصنيف
التكنولوجيا الحيوية (Biotechnology)
سبب أهمّية اكتشاف إنزيم Taq DNA Polymerase المتحمّل لدرجات الحرارة العالية تحديدًا لنجاح تقنية PCR:
تتطلّب مرحلة الفصل في PCR درجات حرارة عالية جدًّا (94-96°C) قد تُتلف الإنزيمات العادية غير المتحمّلة للحرارة، فيلزم إنزيم يتحمّل هذه الدرجات ليستمرّ فعّالًا عبر دورات متكرّرة
لا علاقة بين تحمّل الحرارة ونجاح تقنية PCR
يعمل هذا الإنزيم فقط في درجات الحرارة المنخفضة جدًّا
تحدث جميع مراحل PCR في درجة الحرارة نفسها بلا أي تغيّر
العلاقة بين تصميم سلاسل البدء (Primers) لتكون مكمّلة لتسلسل نيوكليوتيدي محدّد مسبقًا، ونجاح تفاعل PCR في تضخيم المنطقة المطلوبة تحديدًا من DNA دون غيرها:
لا علاقة بين تصميم سلاسل البدء ودقّة استهداف المنطقة المطلوبة من DNA
تُضخَّم جميع أجزاء جزيء DNA بالتساوي بصرف النظر عن تصميم سلاسل البدء
يمكن استخدام أي سلسلة بدء عشوائية للحصول على النتيجة نفسها بدقّة
يضمن التصميم الدقيق لسلاسل البدء ارتباطها فقط بالمنطقة المستهدَفة من DNA، ما يوجّه عملية التضخيم نحو الجزء المطلوب تحديدًا دون باقي الجزيء
اتجاه حركة قطع DNA أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي، بالنظر إلى شحنتها السالبة:
نحو القطب السالب
تبقى القطع ثابتة دون أي حركة
تتحرّك عشوائيًّا دون اتجاه محدّد
نحو القطب الموجب
مجموعة الخطوط الظاهرة بعد عملية الفصل الكهربائي الهلامي، والتي تُستخدَم في هندسة الجينات ودراسة الطفرات والتمييز بين الأفراد:
خرائط القطع (Restriction Maps)
خرائط الجينات فقط
سجلات النسب
المخطّطات الكروموسومية
مثال تقليدي على أحد تطبيقات التكنولوجيا الحيوية المستخدَمة منذ القدم في صناعة الغذاء:
استخدام إنزيمات القطع المحدّد
تقنية تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل
إضافة الخميرة إلى الطحين لإعداد الخبز
العلاقة بين طول قطعة DNA والمسافة التي تقطعها أثناء الفصل الكهربائي الهلامي:
علاقة عكسية؛ كلّما طالت القطعة قطعت مسافة أقلّ
علاقة طردية؛ كلّما طالت القطعة قطعت مسافة أكبر
لا علاقة بين طول القطعة والمسافة المقطوعة
تقطع جميع القطع المسافة نفسها بصرف النظر عن الطول
الغاية من إنتاج أنواع مختلفة من البكتيريا لإنزيمات القطع المحدّد بصورة طبيعية:
تصنيع البروتينات الهيكلية للخلية
المساعدة في عملية التنفّس الخلوي
تحفيز عملية الانقسام الخلوي
الدفاع عن نفسها ضدّ أنواع مختلفة من الفيروسات
حويصلات كروية من الليبيدات المفسفرة، تُستعمل لنقل الأليلات السليمة أو الأدوية في المعالجة الجينية:
الفيروسات آكلة البكتيريا
إنزيمات النسخ العكسي
سبب إنتاج بعض إنزيمات القطع المحدّد لأجزاء متعدّدة الأطوال من جزيء DNA واحد:
عمل الإنزيم على جزيء واحد فقط بصرف النظر عن التسلسل
عدم قدرة الإنزيم على القطع أكثر من مرّة واحدة أبدًا
تكرار منطقة التعرّف التي يتعرّفها الإنزيم في أكثر من موقع على الجزيء نفسه
اختلاف نوع النيوكليوتيدات في كل مرّة قطع
العالِم الذي يُعزى إليه تطوير تقنية تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل (PCR):
واتسون وكريك
كاري موليس
غريغور مندل
توماس مورغان
مكوّن من مكوّنات البلازميد المستخدَم في التكنولوجيا الحيوية، يُسهم في تمييز الخلايا البكتيرية التي استقبلت البلازميد بنجاح من غيرها:
منطقة أصل التضاعف فقط
منطقة التعرّف لإنزيمات القطع المحدّد فقط
الجين المقاوم لأنواع مختلفة من المضادات الحيوية
الغلاف البروتيني للفيروس